2025.09.16

【免疫染色】原理別の工程をイラスト解説(賦活・ブロッキング・染色不良と解決法)

どっとゼブラ

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免疫染色の原理は以下の９種類があります。

酵素抗体法
蛍光抗体法
直接法
間接法
ABC法
LSAB法
(高分子)ポリマー法
PAP法
CSA法

各原理の詳細はこちら

この記事では試験に頻出の
❶酵素抗体法のポリマー法
❷酵素抗体法のABC(LSAB)法
❷蛍光抗体法
の重要工程を詳細解説します。

ぜひ試験対策にお使いください。

この記事の著者

高分子ポリマー法
LSAB(ABC)法
蛍光抗体法
まとめ

高分子ポリマー法

【高分子ポリマー法の手順】

固定
脱パラ・脱キシ・親水
内因性酵素のブロッキング
（水洗）
抗原賦活化
（水洗）
PBS洗浄
非特異的反応のブロッキング
一次抗体反応
（PBS洗浄）
二次抗体反応
（PBS洗浄）
DABなどで発色
（流水水洗）
マイヤーのヘマトキシリンで核染
脱水・透徹・封入

高分子ポリマー法の詳しい原理はこちら

❶【固定液の特徴が重要！】組織や細胞の固定を行う

基本の固定液

組織診：10％中性緩衝ホルマリン
細胞診：95％エタノール

そのほか、以下のアルデヒドを含む固定液も有用とされます。

パラホルムアルデヒド液
PLP液とザンボーニ液の構成要素。
PLP液
免疫染色に有用であるが、糖鎖抗原の検出には✖️。
ザンボーニ液
ピクリン酸を含むため組織が硬化しやすい。

この固定液の詳しい組成はこちら

免疫染色は固定時間も重要です。

固定時間の例

乳癌 HER2
6〜72時間
肺癌 EGFR
6〜48時間

このように何を行うかによって推奨時間が多少変化します。
２日〜３日と覚えておきましょう。

❷脱パラ・脱キシ・親水

組織の場合はパラフィン包埋されているため、パラフィンを溶かしてから水になじませていきます。
パラフィンとは？

２番目の脱キシはアルコールのことです。

❸【試薬が重要！】内因性酵素のブロッキング

体の中にはもともとペルオキシダーゼ(POD)やアルカリホスファターゼ(ALP)などの酵素が存在します。
この酵素を除去しないと余計な部分にも反応してしまうため、工程の序盤で除去します。

以下の図はPODを用いた免疫染色の場合のブロッキング方法です。

このままではすべてが染まってしまい、どこが目的の場所か分かりません
そこで内因性PODを除去すると・・・

除去したい内因性酵素の種類によって使用する試薬は異なります。

内因性PODとALP除去試薬

内因性POD
好中球、好酸球、赤血球などに多く、アルコール固定標本の方がホルマリン固定標本より活性が高い。
【除去試薬】
- 過酸化水素
- 過酸化水素加メタノール
- 過ヨウ素酸
- アジ化ナトリウム
内因性ALP
ホルマリン固定パラフィン包埋切片では影響がなく、細胞診標本や凍結切片では必要。体腔液中の腺癌がもつALPは除去されにくい。
【除去試薬】
- レバミゾール

❹【方法と試薬が重要！】抗原賦活化

【抗原の賦活化】とは”抗原と抗体が反応しやすくなるようにすること”です
主な原因はアルデヒド系固定液で生じるメチレン架橋や有機溶剤など。

このような現象はマスキングとも呼ばれ、これを外す作業が【抗原の賦活化】です。

【賦活化の方法】熱処理 or タンパク分解酵素処理

抗原つまりタンパクは熱や酵素によって構造が変化します。
この構造が変化がマスキングを外します。

熱処理による賦活化

主に核内抗原の検出時に用いられるもので、以下の加熱方法がある。

電子レンジ
オートクレーブ
圧力鍋
温浴槽　など

加熱による賦活を行う際は標本を緩衝液(pH6~7クエン酸緩衝液, pH8EDTA, pH9Tris-EDTAのどれか)に漬けた状態で行う。

加熱後、急速に冷やすとMIB-1などの核内抗原が偽陰性化するため室温でゆっくり冷ます必要がある。

タンパク分解酵素処理による賦活化

主に細胞質抗原の検出に用いられる。
95%エタノール固定の細胞診検体にはあまり使わない。
以下の酵素がある。

トリプシン
ペプシン
プロテイナーゼK　など

この処理を行うことで免疫染色が可能になります。

❺PBS洗浄

抗体との反応が近づいてきたら水は使わず、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を使います。

❻非特異的反応のブロッキング

理想は目的の場所だけに抗体を反応させたいですが、実際は関係ない部分にも反応します。

この関係ない部分への反応を抑えるのが【非特異的反応のブロッキング】です。
反応させたい抗体を添加する前にタンパク成分を敷き詰めることでブロックできます。

非特異的反応のブロッキング試薬

(二次抗体と同じ動物の)正常動物血清
ウシ血清アルブミン
カゼイン　など

❼一次抗体反応

目的の抗原にくっ付く一次抗体を反応させます。
反応後、付いてない抗体を除去するためにPBSで洗浄します。

この時に洗浄が不十分だと、非特異的な反応が増え偽陽性になるため注意。

❽二次抗体反応

ポリマー法では高分子ポリマーが結合した二次抗体を反応させます

反応後、結合していない抗体をPBSで洗います。
この時に洗浄が不十分だと、非特異的な反応が増え偽陽性になるため注意。

❾DABやAECで発色

酵素	POD
基質	DAB	AEC
反応原理	酸化	酸化
発色後の色	茶色	赤色
封入剤	非水溶性	水溶性
永久標本	なる	ならない

POD：ペルオキシダーゼ
DAB：ジアミノベンチジン
AEC：アミノエチルカルバゾール

DABは発がん性（膀胱癌など）がある点にも注意。

反応後、発色反応を止めるために流水水洗します。

DAB発色時の増感方法

DABを用いた場合は感度を上げる増感方法が知られています。

イミダゾール溶液
DAB溶液に添加すると増感される。
重金属イオン水溶液
DAB溶液に1%塩化コバルト水溶液、1%塩化ニッケル水溶液、1%硫酸銅水溶液を添加すると、それぞれ暗青色、紫青色、灰青色に発色する。
クエン酸-酢酸アンモニウム緩衝液
DAB溶解液としてクエン酸-酢酸アンモニウム緩衝液（pH 5.0）を用いる。
オスミウム酸
DAB発色後に1%オスミウム酸溶液で反応。
メセナミン銀液
DAB発色後、PAM染色液で反応。