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免疫染色・ISH
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【イラストあり】FISH法をイラストで完全解説！

どっとゼブラ
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この記事の著者

どっとぜぶら
どっとぜぶら
細胞検査士
臨床検査技師
医学博士
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・細胞検査士試験 １発合格
・12月からの勉強でMT国試150点

少しでも多くのMT, CT学習者の役に立ちたいと思いSNSなどで情報発信中。
テーマは【勉強ができない人はいない。やり方次第で誰でもできる！】
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ぜぶら
ぜぶら

FISH法で分からないことは全てここで解決しよう！　

この記事でわかること
  • FISH法とは？
  • 免疫染色と何が違う？
  • FISH法の特徴
  • FISH法の主な手順
  • FISH法でできることとは
  • FISH法の手順
目次
  1. FISH法とは？
  2. 免疫染色(IHC)とISHの違い
  3. FISH法の特徴
  4. FISH法の主な手順
  5. FISHの判定方法
  6. FISH法でわかる遺伝子変異
  7. 他の遺伝子検査との違い
  8. 問題とポイント

FISH法とは？

FISH法は蛍光を使ったin situ hybridaization（ISH）法のこと。

FISHの言葉の意味
  • F(Fluorescence)
    蛍光
  • IS(in situ)
    その場で
  • hybridaization
    ハイブリダイズする
ぜぶら
ぜぶら

簡単にいうと標本上で特定の遺伝子配列を検出する方法だよ

ハイブリダイズとは？

ハイブリダイズとは核酸の目的配列にプローブをくっ付けるという意味。

プローブは標的核酸と相補的な配列をもった人工的な核酸のこと。

【相補的な配列】など生物学基礎が分からない人はこちら

蛍光を使わない場合もあり、使うものによって下表のように一文字目が変わります。

FISHCISHSISH
検出方法蛍光DAB*など銀
プローブ
標識物		蛍光DIG**などDIG**など
標本の保存性長期保存
しにくい		長期保存が
可能		長期保存が
可能
細胞・組織
形態		見えない見える見える
使う顕微鏡蛍光
顕微鏡		明視野
顕微鏡		明視野
顕微鏡
DABとDIGとは？

*DAB(ジアミノベンジジン)
組織や細胞を染めるために使う試薬の一つ。
酵素反応によって茶色になる性質を利用し、顕微鏡で目的の物質を可視化できる。
たとえば、特定のタンパク質や遺伝子を調べる免疫染色や遺伝子検査で、ペルオキシダーゼという酵素と一緒に使うと、目的の場所が茶色に染まる

**DIG(ジゴキシゲニン)
遺伝子やRNAを調べるときに「目印」として使う小さな化学物質。
プローブ（調べたいDNAやRNAに付くもの）にDIGをくっつけておき、「DIGにくっつく抗体」を使って、その場所を見つけ出す仕組み。
DIG自体は色がついてないが、抗体や酵素と組み合わせることで、染色や検出ができるようになる。

FISH法とはISHの中でも蛍光を使うものを指します。

免疫染色(IHC)とISHの違い

それぞれ検出するものが違います。

  • ISH
    遺伝子
  • 免疫染色(IHC)
    タンパク

核酸とはDNAやRNAのことです。

ぜぶら
ぜぶら

見たいものが違うんだね。

FISH法の特徴

FISH法の特徴まとめ
  1. 蛍光標識プローブを使用
    標的DNAやRNA配列に相補的なプローブに蛍光色素を付けて利用。
  2. 蛍光顕微鏡で観察
    プローブが結合した部位を励起光で照射し、蛍光を蛍光顕微鏡で観察。
  3. 高感度・高特異性
    微量な遺伝子異常や染色体異常も高い感度と特異性で検出可能。
  4. 多重染色が可能
    異なる蛍光色素を使うことで、同時に複数の標的を一つの標本で検出可能。
  5. 細胞や組織の構造を保持したまま解析
    細胞診や組織標本の中で、遺伝子や染色体の異常を可視化できる。
  6. 間期核でも解析可能
    分裂期だけでなく、間期核でも特定遺伝子座や染色体異常を明瞭に検出可。
  7. 培養不要・迅速な解析
    細胞培養が不要でGバンド法よりも迅速に結果が得られる。
  8. 定量性と多用性
    異常細胞の割合を定量評価でき、治療効果判定や移植後経過観察にも有用。
  9. 幅広い応用
    ・遺伝子の増幅、転座、染色体の数的・構造的異常の解析
    ・白血病やリンパ腫、固形腫瘍、脳腫瘍などの診断
    ・産前診断（羊水検査）
    ・細菌やウイルスの検出
  10. 幅広い検体に対応
    組織切片、細胞診標本、乾燥標本でも解析可能。

FISH法の主な手順

FISHの工程は大きく７つに分かれます。
※プローブの種類などにより手順が異なる

ぜぶら
ぜぶら

細胞診試験では工程の温度なども聞かれるので目を通しておこう！

組織標本
細胞診標本
前処理

1)脱パラフィン
2)塩酸
3)蒸留水
4)洗浄緩衝液
(2×クエン酸ナトリウム-食塩緩衝液;SSC)
5)前処理液, 80℃
6)蒸留水
7)洗浄緩衝液

酵素処理

8)プロテアーゼ溶液, 37℃
9)洗浄緩衝液

固定

10)10％中性緩衝ホルマリン
11)洗浄緩衝液

DNA変性

12)変性溶液, 72℃
13)70%および80％エタノール
14)冷風乾燥

ハイブリダイゼーション

15)蛍光プローブ添加, 37℃遮光

洗浄

16)洗浄緩衝液
(SSC+NP-40)
17)冷風乾燥, 遮光

対比染色（核染色）
観察

18)DAPIで対比染色, 遮光
19)蛍光顕微鏡で観察

前処理

1)下降エタノール系列
2)親水
3)10％ホルマリン
4)2×SSC
5)熱処理
（NP-40-クエン酸緩衝液）
6))2×SSC
7)蒸留水
8)100%エタノール
9)乾燥

酵素処理

10)ペプシン/塩酸, 37℃
11)2×SSC
12)蒸留水
13)10％ホルマリン
14)2×SSC /0.1%界面活性剤
15)

固定

13)10％ホルマリン
14)2×SSC /0.1%界面活性剤
15)2×SSC
16)蒸留水
17)上昇エタノール系列
18)乾燥

DNA変性＆ハイブリダイゼーション

19)プローブを滴下
20)DNA変性, 80℃, 遮光
21)ハイブリダイズ, 37℃, 遮光

洗浄

22)2×SSC, 遮光
23)2XSSC/0.1%界面活性剤, 遮光
24)2XSSC, 遮光
25)蒸留水, 遮光
26)乾燥, 遮光

対比染色（核染色）
観察

27))DAPIで対比染色, 遮光
28)蛍光顕微鏡で観察

FISHの判定方法

何を検出するかよって判定方法は異なります。

ぜぶら
ぜぶら

ここでは国試や細胞診試験に関連する以下の３つを紹介するよ！

❶HER2遺伝子増幅
❷EML4-ALK融合遺伝子
❸CDKN2Aホモ欠失

❶HER2遺伝子増幅の判定方法

HER2とは？

HER2は17番染色体の長腕に存在し、HER2タンパクをコードする癌遺伝子。
乳癌、卵巣癌、胃癌、膵癌など、様々な癌で遺伝子増幅の報告がある。

遺伝子の増幅をFISH、タンパクの過剰発現をIHC(免染)で確認することで分子標的治療薬が適応可能かどうかを探る。

判定のポイント！
  1. セントロメアの数に対する目的遺伝子数
  2. １細胞あたりのHER2の数
国試の問題を例に

【71回AM51】
FISH 法による乳癌 HER2 検査の模式図（別冊No. 10）を示す。
HER2 と CEP17 のシグナル比（HER2/CEP17）で最も近いのはどれか。
1． 0.5
2． 1.0
3． 3.0
4．10.0
5．50.0

出典：第71回臨床検査技師国家試験問題および正答について
Q
答えと解説

答え：３
解説
HER２遺伝子(黒)の数は全部で49、セントロメア(白)の数は全部で16。
シグナル比(HER2/CEP17)=49÷16≒3

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Q
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【陽性、陰性の判定結果】

  1. ISH陽性
    HER2／CEP17比が2倍以上かつ1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4以上
  2. ISH陰性
    HER2／CEP17比が2倍未満、1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4未満
  3. その他
    • HER2／CEP17比が2倍以上、1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4未満の場合、同一切片で追加のIHC法を行い，IHC法3+であればHER2陽性，0, 1+ならHER2陰性。
      2+の場合は初回の検査結果を伏せてISH法を再検し，同様にHER2／CEP17比が2倍以上で1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4未満であれば、最終的にHER2陰性。
    • HER2／CEP17比が2倍未満で1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が6以上の場合，同一切片で追加のIHC法を行い，IHC法3+であればHER2陽性，0, 1+ならHER2陰性と判定。
      2+の場合は初回の検査結果を伏せてISH法を再検し，同様にHER2／CEP17比が2倍未満で1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が6以上であればHER2陽性。
    • HER2／CEP17比が2倍未満で1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4以上6未満の場合，同一切片で追加のIHC法を行い，IHC法3+であればHER2陽性，0, 1+ならHER2陰性と判定。
      2+の場合は初回の検査結果を伏せてISH法を再検し，HER2／CEP17比が2倍未満で1細胞あたりの平均HER2遺伝子コピー数が4以上6未満の場合HER2陰性

参考、引用：乳癌診療ガイドライン2022年版

❷EML4-ALK融合遺伝子の判定方法

EML4-ALK融合遺伝子とは？

2番染色体短腕内に反対向きで存在する「EML4遺伝子」と「ALK遺伝子」の一部が、突然変異（逆位）によって同じ向きに連結した異常な遺伝子。

この融合遺伝子ができると、そこから「EML4-ALK融合タンパク」という特殊なタンパクが作られる。

この融合タンパク質は、細胞の増殖などに関わるALKタンパク質のスイッチが常にオンになったような状態を作り出し、細胞が増え続ける原因となる。

EML4-ALK融合遺伝子のイメージ
判定のポイント！
  1. 赤、緑、黄色の３色
  2. break-apart法では融合遺伝子があると赤と緑が離れて存在する
  3. break-apart法で正常部分は黄色が見える

EML4-ALK融合遺伝子の検出は一般的にbreak-apart法が用いられます。
この方法はALK遺伝子のみに結合する２色のプローブを使用します。

矢印がALK遺伝子の部分

【正常(下画像左)の場合】
プローブ①と②の位置が近く、赤と緑、そしてその２色が混色(今回は黄色)の３色が見られます。

【異常(下画像右)の場合】
融合遺伝子の場合はプローブ①と②の距離が遠いため、赤と緑が単色に見えます。

ぜぶら
ぜぶら

ALKとEML4遺伝子に結合するプローブを使った方法はfusion assayと呼ばれるよ。

これは赤、緑、黄色の３色がある方が異常判定になる。
方法によって判定が真逆になるので気をつけよう！

  • break-apart assay
    「単色（切断）」が陽性
  • fusion assay
    「混色（融合）」が陽性

❸CDKN2Aホモ欠失の判定方法

CDKN2Aホモ欠失とは？

細胞が異常に増殖するのを防ぐブレーキのような役割を持つ「がん抑制遺伝子」の一つ。
具体的には、p16INK4aやp14ARFといった、細胞周期などに関わる重要なタンパク質をコードする遺伝子。
この遺伝子の欠失は悪性中皮腫の検出などに用いられる。

判定のポイント！
  1. セントロメアは見えるが、目的遺伝子が見られない

FISH法でわかる遺伝子変異

他の遺伝子検査との違い

細胞周期の間期でも検査できる

間期って何だ？

細胞は細胞周期を回すことで増殖します。
この中のG1~G2期までを間期と呼びます。

ISH以外で遺伝子検査をする方法として染色体を検査があります。
染色体検査する場合はM期でしか検査来ません。
染色体はM期にしか作られないからです。

でもISHは細胞周期の何期でも検査できます。

遺伝子転座（キメラ遺伝子）の検出

FISHでは遺伝子の転座が検出できます。

転座・・・？

転座とは遺伝子Aと遺伝子Bの一部が入れ替わることです。

こうなることで違う遺伝子の組み合わせができます。

これでできる遺伝子をキメラ遺伝子と呼ぶよ

例えば慢性骨髄性白血病で有名なBCR-ABL遺伝子をFISHで検出するとこのように見えます。

BCRを緑、ABLを赤に染めた場合

正常の場合BCRとABLは離れた位置にあります。
BCRとABLが融合すると赤と緑の色が近くなり黄色の融合遺伝子ができます。
（緑と赤が混ざると黄色になる）

これでキメラ遺伝子があることが分かります。

問題とポイント

Q. FISH 法について正しいのは？２つ選べ

  1. 標本は永久標本となる
  2. 染色体転座の検出に用いる
  3. 観察には偏光顕微鏡を用いる
  4. キメラ遺伝子の検出に用いる
  5. 核はFITCで染色する

答えはココ

FISH 法のポイント
  1. ターゲットは核酸
  2. 蛍光を使う
  3. 遺伝子の転座や増幅が分かる

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